IPS诱导肠类器官的培养分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导、类器官培养。本文将重点介绍第一阶段——人多能干细胞的培养。

一、实验准备：

1. 人多能干细胞培养基的配制：

1. 将hPSC Medium Supplement在2-8℃下解冻，融化后上下轻轻晃动以充分混匀，按需分装，立即使用或储存于-20~-80℃，避免反复冻融。
2. 按照1:50的比例，将10mL hPSC Medium Supplement加入到500mL hPSC Medium Basal Medium中，混合均匀即可得到人多能干细胞培养基（abs9403）。需要注意的是，配制好的培养基在2-8℃下可稳定保存2至3周，不建议使用配制超过3周的培养基。
3. 实验试剂平衡：人多能干细胞培养基在实验前应放置于室温避光平衡；PBS和消化液需要在37℃条件下加热。特别注意：培养基中含有活性因子，切勿在37℃水浴中加热。

二、操作方法（所有步骤应在无菌条件下进行）：

hPSC细胞复苏：

1. 基质胶包被培养板：准备6孔板或12孔板，每孔加入1mL或0.5mL基质胶（abs9410），轻轻摇动，使其完全覆盖皿底，置于37℃培养箱中孵育1至2小时。实验前取出并在超净工作台中室温平衡20分钟。如暂时不使用，可用Parafilm封口后在2-8℃保存，需在一周内使用。
2. 加入2~3mL的干细胞培养基至15mL离心管中备用。
3. 迅速解冻：将冻存管从液氮中取出，快速浸入37℃温水中并快速摇动，使其在1~2分钟内迅速解冻。注意，尽量减少细胞暴露于室温的时间。
4. 离心：将冻存管中的冻存液逐滴加入含有干细胞培养基的15mL离心管中，平衡后以1000rpm离心3分钟。
5. 重悬：离心后弃去上清，加入1mL人多能干细胞培养基，对干细胞沉淀进行吹吸混匀，吹吸3~5次。
6. 接种：均匀混合后，弃去已平衡的基质胶，将细胞悬液加入已包被的6孔板中，补全每孔2mL培养体系。
7. 培养：接种后的6孔板可置于显微镜下观察，确保细胞团块呈现4个以上的细胞为合格。轻轻摇动6孔板，使细胞均匀分布，并置于37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养，第二天观察细胞贴壁情况。
8. 每24小时更换一次培养基，因培养基中的活性成分仅能支持一天，因此必须及时更换新鲜培养基。

hPSC细胞传代：

具体操作步骤：

1. 清洗：吸去原有培养基，缓慢加入1mL PBS缓冲液，轻轻晃动后沿培养皿边缘吸去PBS。
2. 消化：在6孔板中加入2mL人多能干细胞消化液（abs9409），覆盖皿底，置于37℃培养箱中2~5分钟。
3. 吹打：吸掉消化液后，加入2mL人多能干细胞培养基，用移液枪轻柔吹打培养皿底3~5次，使干细胞集落脱落，并转移至15mL离心管中。
4. 离心：以1000rpm离心3分钟，弃上清。
5. 接种：用干细胞培养基轻轻吹打细胞5-10次，吸去包被培养板中的基质胶，加入细胞悬液，补全每孔2mL的培养体系。
6. 同样，从传代开始每24小时换液一次，确保培养基的新鲜性。

hPSC细胞冻存：

实验具体操作步骤：

1. 清洗：同前。
2. 消化：同前。
3. 吹打与离心：同前操作。
4. 重悬：在离心后弃去上清，加入2mL ES/iPS细胞冻存液（abs9412）并混匀，随后转移至冻存管中。
5. 记录：在冻存管上标记细胞种类、冻存时间、操作人员及细胞批次。
6. -80℃冰箱冻存：将冻存管直立放置于-80℃冰箱中过夜。
7. 液氮冻存：24小时后将细胞转移至液氮中进行长期冻存。

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